关键词： 静态流动模式、BSA蛋白、分子量分布、凝胶渗透色谱、光散射、SEC-RI

引言：
BeNano 纳米粒度及 Zeta 电位分析仪的静态流动模式，是专为与凝胶渗透色谱（GPC/SEC）系统联用而设计的高效检测方案。该模式结合 GPC/SEC 强大的组分分离能力与光散射的绝对分子量测定优势，为蛋白质等生物大分子的精细表征提供了有力工具。本应用报告展示了该模式在分析牛血清白蛋白（BSA）分子量及其分布状态方面的出色表现。

核心原理与设备配置：

1. 前端分离： 实验中采用市场主流品牌的凝胶色谱系统（SEC/GPC），配备示差折光检测器（RI），使用 TSK 氧化硅色谱柱对样品进行精确分离。SEC 依据分子尺寸差异，将样品中的不同组分依次分离洗脱。

2. 核心检测： 使用丹东百特 BeNano 180 Zeta Max 分析仪（配置静态流动模式模块）。仪器核心光源为 671 nm、50 mW 的激光器，在 90° 角度精确收集样品的静态光散射（SLS）信号。

3. 信号联动： 采用 BFC-1 信号采集器，同步接收并整合来自前端 SEC 系统的示差折光检测器（RI）输出的模拟信号。

4. 流通池： 测试选用 27μL 低容量流通池，确保高灵敏度和低扩散。

5. 理论基础： BeNano 采用单角度静态光散射技术。根据瑞利散射理论，只要被测分子尺寸不超过入射光波长的 1/40，即可保证分子量测定结果的准确性，这一特性使其特别适用于蛋白质类样品的检测。

样品制备与测试条件：

• 样品：牛血清白蛋白（BSA）。

• 溶剂：pH = 7 的 PBS 缓冲液。

• 浓度：5 mg/mL。

• 进样量：100 μL。

• 流速：0.7 mL/min。

• 温度：BeNano 检测池温度严格控制在 25°C，与室温环境保持一致。

• 流程：样品溶液经 SEC 系统进样并完成色谱柱分离后，分离的组分按分子大小顺序依次流经 RI 检测器和 BeNano 的流通池，同步采集 RI 信号和 SLS 信号。

实验结果与深入分析：

1. 流出峰图： BSA 样品经色谱柱分离后，洗脱曲线呈现多个明显的流出峰。这一现象清晰表明，在测试条件下，BSA 在 PBS 缓冲液中并非单一状态，而是存在不同尺寸的聚集体。

2. 分子量计算： 通过对 RI 信号和光散射信号进行基线校正和峰积分处理，精确计算出每个洗脱峰对应的重均分子量（Mw），结果汇总于表 1。

3. 分子量分布曲线： 对整体信号进行积分处理，绘制出分子量随洗脱体积变化的分布曲线。该曲线清晰显示：随着洗脱体积增加（即流出时间延长），分子量呈现规律性下降。这完全符合凝胶色谱“大分子先流出，小分子后流出”的基本分离原理。值得注意的是，在每个独立的洗脱峰内部，分子量均保持相对稳定的平台状态，这与蛋白质在特定寡聚状态下分子量分布高度均一的特性高度吻合。

4. 聚集体判定：

• 峰1（最后流出的峰）的 Mw 测定值约为 66K，与 BSA 单体的理论分子量精确吻合。

• 峰2、峰3、峰4 的 Mw 测定值分别约为峰1的 2 倍、3 倍和 4 倍。

• 据此可明确判断：峰2代表BSA二聚体，峰3代表三聚体，峰4代表四聚体。

结论：

本应用报告成功利用丹东百特 BeNano 180 Zeta Max 的静态流动模式，实现了对 BSA 蛋白样品的分子量及其分布状态的精确表征。实验结果充分证明：

• BeNano 静态流动模式能够与 SEC/RI 系统无缝联用，准确测定洗脱液中各分离组分的绝对分子量。

• 基于测得的分子量数据，能够清晰地分辨和鉴定 BSA 样品中存在的不同寡聚状态（单体、二聚体、三聚体、四聚体）。

• 该技术方案为复杂蛋白质样品的分子量及聚集行为研究提供了可靠、高效的检测手段。